Biokimia kromatigrafi kolom dan pigmen plastida
I.
TUJUAN
Memisahkan
komponen zat warna atau pigmen dalam ekstrak daun papaya yaitu karoten,
xantofil, klorofil A, dan klorofil B dengan menggunakan metode kromatogram
kolom dengan pigmen plastida
II.
PRINSIP
2.1
Berdasarkan Hukum Distribusu Nernts
“Jika
suau zat dalam dua pelarut yang tidak saling bercampur, rasio fraksional zat
yang terlarut dalam pelarut keseimbangan adalah suatu konstanta”
Kd
= C1/C2
Dimana:
Kd : koefisien distribusi
C1 : konsentrasi zat terlarut pada
pelarut 1
C2 : Konsentrasi zat terlarut pada
pelarut 2
2.2
Berdasarkan Hukum “Like Dissolved Like”
“Senyawa
polar akan relative larut dalam pelarut polar dan senyawa yang non polar akan
relative larut dalam pelarut non – polar”.
2.3
Berdasarkan proses adsorpsi masing – masing komponen ekstrak daun papaya di
dalam kolom
2.4
Berdasarkan pada perbedaan kecepatan migrasi differensial dan zat yang
dipisahkan di antara dua fasa yaitu selulosa sebagai fasa diam
III.
Teori
Kromatografi kolom merupakan teknik
kromatografi yang paling awal yang pertamakali di lakukan oleh D.T.Davy yaitu
untuk membedakan komposisi minyak bumi. Ditinjau dari mekanismenya kromatografi
kolom merupakan kromatografi serapan atau adsorbsi. Kromatografi kolom digolongkan
kedalam kromatografi cair – padat (KCP) kolom terbuka. Pemisahan kromatografi
kolom adsorpsi didasarkan pada adsorpsi komponen-komponen campuran dengan
afinitas berbeda-beda terhadap permukaan fase diam. Kromatografi kolom adsorpsi
termasuk pada cara pemisahan cair- padat. Substrat padat (adsorben) bertindak
sebagai fase diam yang sifatnya tidak larut dalam fase cair. Fase bergeraknya
adalah cairan (pelarut) yang mengalir membawa komponen campuran sepanjang
kolom. Prinsip yang mendasari kromatografi kolom adsorpsi ialah bahwa komponen
– komponen dalam zat contoh yang harus diperiksa mempunyai afinitas yang
berbeda-beda terhadap adsorben dalam kolom. Apabila kita mengalirkan cairan (
elutor ) secara kontinyu melalui kolom yang berisi zat contoh yang telah
diadsorpsikan oleh penyarat kolom, maka yang pertama – tama dihanyutkan
elutor ialah komponen yang paling lemah terikat kepada adsorben. Komponen
–komponen lainnya akan dihanyutkan menurut urutan afinitasnya terhadap
adsorben, sehingga terjadi pemisahan daripada komponen – komponen tersebut.
Pemisahan tergantung pada kesetimbangan yang terbentuk pada bidang antarmuka di
antara butiran-butiran adsorben dan fase bergerak serta kelarutan relatif
komponen pada fase bergeraknya. Antara molekul-molekul komponen dan pelarut
terjadi kompetisi untuk teradsorpsi pada permukaan adsorben sehingga
menimbulkan proses dinamis. Keduanya secara bergantian tertahan beberapa saat
di permukaan adsorben dan masuk kembali pada fase bergerak. Pada saat
teradsorpsi komponen dipaksa untuk berpindah oleh aliran fase bergerak yang
ditambahkan secara kontinyu. Akibatnya hanya komponen yang mempunyai afinitas
lebih besar terhadap adsorben akan secara selektif tertahan. Komponen dengan
afinitas paling kecil akan bergerak lebih cepat mengikuti aliran pelarut.
Teknik pemisahan kromatografi kolom partisi sangat mirip dengan kromatografi
kolom adsorpsi. Perbedaan utamanya terletak pada sifat dari penyerap yang
digunakan. Pada kromatografi kolom partisi penyerapnya berupa materi padat
berpori seperti kieselguhr, selulosa atau silika gel yang permukaannya dilapisi
zat cair (biasanya air). Dalam hal ini zat padat hanya berperan sebagai
penyangga (penyokong) dan zat cair sebagai fase diamnya. Fase diam zat cair
umumnya diadsorpsikan pada penyangga padat
yang sejauh mungkin inert terhadap
senyawa- senyawa yang akan dipisahkan. Zat padat yang penyokong harus penyerap
dan menahan fase diam serta harus membuat permukaannya seluas mungkin untuk
mengalirnya fase bergerak. Penyangga pada umumnya bersifat polar dan fase diam
lebih polar dari pada fase bergerak. Dalam kromatografi partisi fase
bergeraknya dapat berupa zat cair dan gas yang mengalir membawa
komponen-komponen campuran sepanjang kolom. Jika fase bergeraknya dari zat
cair, akan diperoleh kromatografi partisi cair-cair. Teknik ini banyak
digunakan untuk pemisahan senyawa-
senyawa organik maupun anorganik.
Fotosintesis adalah suatu proses
biokimia yang dilakukan tumbuhan, alga, dan beberapa jenis bakteri untuk
memproduksi energi terpakai (nutrisi) dengan memanfaatkan energi cahaya. Hampir
semua makhluk hidup bergantung dari energi yang dihasilkan dalam fotosintesis.
Akibatnya fotosintesis menjadi sangat penting bagi kehidupan di bumi.
Fotosintesis juga berjasa menghasilkan sebagian besar oksigen yang terdapat di
atmosfer bumi. Organisme yang menghasilkan energi melalui fotosintesis (photos
berarti cahaya) disebut sebagai fototrof. Fotosintesis merupakan salah satu
cara asimilasi karbon karena dalam fotosintesis karbon bebas dari CO2 diikat (difiksasi)
menjadi gula sebagai molekul penyimpan energi. Cara lain yang ditempuh
organisme untuk mengasimilasi karbon adalah melalui kemosintesis, yang
dilakukan oleh sejumlah bakteri belerang. Tumbuhan menangkap cahaya menggunakan
pigmen yang disebut klorofil. Klorofil merupakan katalisator fotosintesis yang
sangat penting dalam semua jaringan tumbuhan berfotosintesis. Klorofil terdapat
dalam kloroplas dan sering berkaitan dengan protein, tetapi mudah diekstraksi
ke dalam pelarut lipid. Di dalam tumbuhan, paling sedikit terdapat lima jenis
klorofil. Secara kimia, seluruh jenis klorofil mengandung satu inti porfirin
dengan satu atom Mg terikat di tengah. Perbedaan setiap jenis klorofil
disebabkan perbedaan dalam rantai alifatik yang terikat pada inti porfirin.
Klorofil bersifat labil, selama isolasi dapat mengurai atau kehilangan atom Mg.
Klorofil yang kekurangan rantai samping pirol akan membentuk klorofilida,
sedangkan klorofil yang kehilangan atom Mg akan membentuk protoklorofil. Selain
klorofil, di dalam tumbuhan juga terdapat
pigmen warna lain yang disebut
karotenoid. Selain sebagai pigmen warna, karotenoid juga membantu dalam
fotosintesis. Terdapat lebih dari 300 jenis
karotenoid, tetapi yang terdapat dalam
tumbuhan tinggi hanya sedikit, umumnya berupa karoten. Salah satu turunan
karotenoid, yaitu hidrokarbon tak jenuh
turunan likopen atau turunan likopen
teroksigenesi dikenal sebagai xantofil. Xantofil yang umum terdapat berupa
monohidroksikaroten (ketrin dan rubixantin), dihdroksi-karoten (zeakantin) atau
dihidroksi- epoksikaroten (violaxantin). Untuk memisahkan zat-zat warna yang
terdapat pada
suatu tumbuhan dapat dilakukan dengan
berbagai cara, tetapi teknik kromatografi merupakan teknik yang banyak
digunakan. Kromatografi pertama kali
diberikan oleh Michael Tswett, seorang
ahli botani Rusia, pada tahun 1906.
Kromatografi berasal dari bahasa Yunani
‘Kromatos’ yang berarti warna dan ‘Graphos’ yang berarti menulis.
Kromatografi merupakan metode
pemisahan yang sederhana. Kromatografi
mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada perbedaan distribusi dari
penyusunan cuplikan antara dua fasa,
salah satu diantaranya bergerak secara
berkesinambungan dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan
perbedaan mobilitas disebabkan adanya perbedaan dalam absorpsi, partisi,
kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion dinamakan
kromatografi sehingga masing-masing zat dapat diidentifikasi atau ditetapkan
dengan metode analitik (Anonim, 1995). Pada dasarnya, teknik kromatografi ini
membutuhkan zat terlarut terdistribusi di antara dua fase, satu diantaranya
diam (fase diam), yang lainnya bergerak (fase gerak). Fase gerak membawa zat
terlarut melalui media, hingga terpisah dari zat terlarut lainnya yang
tereluasi lebih awal atau lebih akhir. Umumnya zat terlarut dibawa melewati
media pemisah oleh cairan atau gas yang disebut eluen.
Fase diam dapat bertindak sebagai zat
penyerap atau dapat betindak melarutkan zat terlarut sehingga terjadi partisi
antara fase diam dan fase gerak (Anonim, 1995).
IV. Gambaran umum
Pada praktikum kali ini akan dibahas
mengenai pemisahan zat-zat warna pada daun tumbuhan Manihot esculentum
(menggunakan daun yang sangat tua karena banyak mengandung klorofil) secara
kromatografi. Kromatografi digunakan untuk memisahkan campuran dari
substansinya menjadi komponen-komponennya. Adapun kromatografi yang digunakan
adalah kromatografi kertas karena menggunakan kertas saring. Seluruh bentuk
kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau cairan yang didukung pada
padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase
diam dan membawa komponen-komponen dari campuran bersama-sama.
Komponen-komponen yang berbeda akan bergerak pada laju yang berbeda pula. Dalam
kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap sedangkan fase gerak adalah
pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Untuk melarutkan klorofil digunakan
petroleum ether karena klorofil tidak larut dalam air. Setelah ekstrak
didapatkan, estrak diteteskan pada kertas kromatografi dengan menggunakan jarum
suntik setetes demi setetes hingga berwarna hijau pekat. Namun sebelum itu,
ujung kertas dibuat bentuk segitiga dan pada bagian tengahnya diberi tanda
titik kecil sebagai bagian dalam penetesan ekstrak. Kertas dimasukkan ke dalam tabung
kultur dan tabung ditutup agar tidak ada udara yang masuk. Alasan untuk menutup
tabung adalah untuk meyakinkan bahwa udara dalam tabung terjenuhkan dengan uap
pelarut. Penjenuhan udara dalam tabung dengan uap menghentikan penguapan
pelarut sama halnya dengan pergerakan pelarut pada kertas. Setelah beberapa
menit didapatkan hasil seperti di
atas. Berdasarkan gambar hasil
kromatografi di atas, sehingga kita dapat membandingkan pigmen mana yang
menempuh jarak paling jauh. Dari grafik di atas dapat kita lihat bahwa urutan
pigmen pada kertas dari yang terkecil ke yang terbesar adalah kuning
(Xantofil), hijau muda (Klorofil b), hijau tua (Klorofil a), dan jingga
(Karoten). Artinya Karoten meenempuh jarak yang paling jauh dari titik awal dan
yang menempuh jarak yang paling dekat adalah Xantofil. Seperti yang kita
ketahui bahwa rumus kimi dari pigmen tersebut antara lain Xantofil
{C4OH54(OH)2}, Klorofil A {C55H72O5N4Mg}, Klorofil B {C55H70O6N4Mg}, dan
Karoten {C4OH56}. Jadi, dapat kita simpulkan bahwa berat molekul Karoten lebih
kecil disusul oleh Xantofil, Klorofil A, dan berat molekul terbesar adalah
Klorofil B (dapat dilihat dari banyaknya atom C dan atom O), sehingga urutan
pigmen yang menempuh jarak terjauh adalah Karoten, Xantofil, Klorofil A, dan
Klorofil B. Namun, hasil pengamatan kami tidak sesuai dengan teori tersebut.
Adapun ketidakcocokan hasil pengamatan dengan teori dapat disebabkan oleh
kesalahan praktikan baik pada waktu pengamatan yang kurang lama ataupun pigmen
sebenarnya belum terhenti benar sehingga hasil pengamatan tidak sesuai dengan
fakta yang ada.
DAFTAR
PUSATAKA
Sudjadi.1988.Metode
Pemisahan. Konsius: Yogyakarta.
Arsyad,
M. Natsir, 2001, Kamus Kimia Arti dan
Penjelasan
Istilah , Gramedia: Jakarta.
Aswad.2001.Kimia
Untuk Universitas.Erlangga :
Jakarta.
Bernaseoni,G.
2005. Teknologi Kimia . PT Padya
Pranita:
Jakarta.
Desti.
2015. Kromatografi Kolom. http://destirumapea24.blogspot.co.id/2015/03/kromatografi-kolom.html
Keenan,
Charles W. dkk. 2002. Kimia Untuk
Universitas
Jilid 2 . Erlangga: Jakarta.
Mulyadi.
2006. Pengenalan Ilmu Kimia . Bumi aksara:
Jakarta
Syukri.
2000. Kimia Dasar 3 . ITB Press: Bandung.
Synder,
L.R,J.J. Kirkland, dan J.L.Glajch. 1997. HPLC
Method
Development . New York: John Willey & Sons.
Watson,
G David. 2005. Analisis Farmasi edisi 2.
Penerbit
Buku Kedokteran: Jakarta.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar