Pemisahan Albumin dan Globulin dari Serum Darah dengan Cara Elektroforesis Kertas

PEMISAHAN ALBUMIN DAN GLOBULIN DARI SERUM DARAH DENGAN CARA ELEKTROFORESIS KERTAS

I.          TUJUAN

1.1      Tujuan Umum

Memisahkan albumin dan globulin dalam serum darah dengan metode elektroforesis kertas melalui tahap fraksionasi dan desalting

1.2      Tujuan Khusus

1.2.1     Fraksionasi

Memisahkan albumin dan globulin serum darah dengan menambahkan amnium sulfat

1.2.2     Resolving

Memisahkan dan memurnikan albumin dan globulin dari garamsulfat dan pengotor – pengotornya

1.2.3     Elektroforesis

Mengetahui muatan dari albumin dan globulin serta pergerakannya dari bidang listrik

II.        PRINSIP

2.1      Fraksionasi

Berdasarkan perbedaan kelarutan dari albumin dan globulin dalam ammonium sulfat

2.2      Desalting

Berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi akibat perbedaan ukuran dan massa serta absorban di garam – garam dan pengotor – pengotor

2.3      Elektroforesis

Berdasarkan migrasi partikel – partikel bermuatan di dalam medan listrik dan pH tertentu

III.      DASAR TEORI

Darah bersifat alkalis lemah dengan Ph 7,36 berfungsi sebagai alat transport zat-zat terutama O2, mengatur reaksi-reaksi tubuh supaya konstan, untuk regulasi panas badan dan pelindung terhadap kemungkinan infeksi. Darah terdiri dari sel darah (eritrosit, leukosit, trombosit) dan plasma darah (fibrinogen, serum darah yang terdiri dari albumin dan globulin). Sampel darah yang akan ditentukan dapat berupa darah, plasma darah, serum darah. Plasma darah adalah darah minus sel-sel darah dan masih mengandung fibrinogen.Dalam plasma terdapat anti koagulen yang sengaja ditambahkan guna mencegah penjendalam.Plasma tanpa fibrinogen disebut serum dan tidak mengandung bahan koagulan (Setyaningrum, 2001).

Plasma darah mengandung beberapa senyawa baik anorganik maupun organik yang meliputi antara lain : Protein darah, sari makanan, garam mineral, getah secret sel seperti enzim, hormon, zat-zat ekskresi.

Plasma darah (7%), meliputi :

·      Fibrinogen : Untuk pembekuan darah (0,3%)

·      Albumin     : Menjaga tekanan osmotic darah    (4%)

·      Globulin     : Membentuk zatkebal/zat antibiodi (2,7%)

Berdasarkan kerjanya zat anti (anti body) dibedakan :

·      Prepsipitasi        : kerjanya mengendapkan darah

·      Aglutinasi          : menggumpulkan

·      Netralisasi         :antigenik menutup tempat yang tosik (beracun)

·      Lisin                  : menyerang dan memecah antigen

·      Antitoksin         : menetralkan racun

Istilah penting lain dalam plasma darah yaitu:

·      Serum : Cairan darah/plasma yang tidak mengandung Fibrinogen(komponen pembeku darah).

·      Anti body : Protein yang dapat mengenali dan mengikat antigen (proteinasing) tertentu.

·      Antigen : Molekul protein asing yang tidak dikenal yang masuk keplasma darah.

Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimen dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptide.

Hematokrit merupakan ukuran yang menentukan banyaknya jumlah sel darah merah dalam 100 mg darah yang dinyatakan dalam (%). Leukosit (White Blood Cell/WBC) merupakan komponen darah yang berperan dalam memerangi infeksi yang disebabkan oleh virus, bakteri, ataupun proses metabolic toksin, dll. Trombosit (platelet) merupakan bagian dari sel darah yang berfungsi membantu dalam proses pembekuan darah dan menjaga integritas vaskuler. Eritrosit (Red Blood Cell/RBC) merupakan komponen darah yang paling banyak dan berfungsi sebagai pengangkut/pembawa oksigen dari paru-paru untuk diedarkan ke seluruh tubuh dan membawa karbon dioksida dari seluruh tubuh ke paru-paru.

Laju endap darah adalah kecepatan zedimentasi eritrosit dalam darah yang belum membeku dengan satuan mn/jam.

Fungsi darah :

·      Membawa produk sisa metabolism sel ke organ yang akan mengekskresikannya.

·      Melawan infeksi (leukosit dan antibodi)

·      Membawa zat yang dibutuhkan kelenjar untuk menghasilkan secret

·      Mendistribusikan secret kelenjar dan enzim.

·      Mendistribusikan panas ke seluruh tubuh.

·      Menjaga asam-basa darah

·      Menghentikan perederan (proses pembekuan)

IV.      GAMBARAN UMUM

Serum adalah plasma darah (mengandung sekitar 90% air) tanpa fibrinogen. Serumdarah terdiri dari protein (yang tidak digunakan untuk pembekuan darah) termasuk cairanelektrolit, antibodi, antigen, hormon, dan semua substansi exogenous. Protein yang terdapatdalam serum terdiri dari albumin,  -α globulin, β-globulin, dan  γ-globulin. Protein globulinyang terdapat pada serum memiliki berbagai fungsi bioligik, Diantaranya α-globulin yaitutranskobalamin yang mengangkut vitamin B12 dan transkortin yang mengangkut kortisol, β-globulin bertanggungjawab untuk transport besi bervalensi tiga dalam plasma,  γ-globulinmerupakan glikoprotein yang berperan pada reaksi imun sehingga disebut immunoglobulin(IgG). Sedangkan albumin berperan besar untuk ikatan protein obat.Prosedur pertama yaitu fraksionasi dengan ammonium sulfat. Serum darah 1 mLditambahkan ammonium sulfat jenuh 1 mL pertetes sambil diaduk. Penambahan pertetessambil diaduk ini bertujuan agar pencampurannya merata. Kemudian disentrifugasi selama 15menit dengan kecepatan 6000 rpm. Disentrifugasi juga agar reaksinya lebih sempurna dimanasentrifugasi merupakan pemisahan berdasarkan kecepatan  sedimentasi komponen  proteinakibat adanya gaya sentrifugal. Selanjutnya dipisahkan supernatan albumin dari endapanglobulin dengan cara didekantasi. Kemudian endapan globulin dicuci dengan ammoniumsulfat 50% dan kembali didekantasi. Pencucian ini bertujuan untuk melarutkan atau mengikatammonium sulfat atau pengotor yang tidak berikatan dengan albumin. Endapan globulin yangdidapat selanjutnya dilarutkan dengan 2 mL air. Pelarutan dengan air ini agar dapat dilakukanuntuk proses selanjutnya yaitu desalting. Sehingga hasilnya adalah supernatant albumin danlarutan globulin.Prosedur  pertama ini  yaitu untuk memisahkan protein  dengan  cara  pengendapandengan penambahan larutan garam berkonsentrasi tinggi yang biasa disebut dengan saltingout. Protein mempunyai struktur yang tidak stabil sehingga mudah mengalami denaturasiyang meliputi presipitasi dan koagulasi. Albumin merupakan protein yang larut dalam airsedangkan globulin mempunyai sifat sukar larut dalam air. Akan tetapi didalam serum yangmengandung kedua protein (albumin dan globulin) ini ditambahkan garam ammonium sulfat50%, maka protein akan terdenaturasi atau daya larut globulin akan berkurang sehinggaglobulin akan terpisah sebagai endapan. Denaturasi protein ini dipengaruhi oleh adanyagaram logam berat, pH, panas, perubahan tipe pelarut, dll. Pada denaturasi terjadi perubahanterhadap   struktur   sekunder,   tersier,   dan   kuarterner   molekul   protein   tanpa   terjadinyapemecahan ikatan kovalen sehingga terkadang dapat berlangsung secara reversible dan dapatmengalami  renaturasi  atau  penyusunan  kembali molekul protein. Dimana globulin akanmengendap pada penambahan garam ammonium sulfat 50% sedangkan albumin akan larutpada penambahan ammonium sulfat 50%. Pengendapan dapat terjadi karena saat ammoniumsulfat 50% ditambahkan pada larutan protein,  ion-ion garam ammonium sulfat menarikmolekul air dan albumin menjauh dari globulin. Hal ini disebabkan ion-ion pada garamammonium sulfat memiliki muatan berat jenis yang lebih besar dibanding protein, sehinggaketika ditambahkan akan berikatan dengan molekul air dan albumin yang dapat memaksaglobulin   berinteraksi   dan   ketika   penambahan   ammonium   sulfat   dalam   jumlah   cukupmenyebabkan globulin terpresipitasi.

Prosedur selanjutnya yang  kedua yaitu  proses  desalting. Kolom  disiapkan dalamkeadaan   bersih   dan   kering.   Kemudian   didalam   kolom   dilapisi   dengan   larutan   natriumklorida1%. Selanjutnya kolom diisi dengan sedikit kapas dan matriks spadex G-25 setinggi12 cm lewat dinding kolom dan dielusi dengan natrium klorida 1 %. Penambahan kapasbertujuan untuk menahan matriks keluar dari kolom. Digunakan matriks spadex G-25 karenaMatriks diatur hingga kompak dengan tetesan yang konstan. Kemudian sampel albumindimasukkan kedalam kolom yang sudah berisi kapas, matriks dan larutan natrium kloridasedikit diatas matriksnya. Eluat ditampung kedalam 8 fraksi (tabung reaksi), tiap fraksi berisi1 mL. tiap fraksi diteteskan pada kertas saring, lalu nodanya diwarnai dengan bromfenol biru.Fraksi dengan noda terpekat selanjutnya dipakai untuk proses elektroforesis.Pada   kolom   filtrasi   gel,   pengembangan   endapan   isoelektrik   bisa   menjadi   gangguan.Agregat   dapat   menyumbat   kolom,   atau   diendapkan   dan   terjebak.   Mereka   tetap   di   belakanghingga garam dihapus dari campuran protein asli menangkap dan pelarutan kembali endapan.Penghilangan   garam   dri   gel   filtrasi   hanya   mungkin   tidak   bekerja   di   bawah   kondisi   ini.Presipitasi   isoelektrik   protein   berkelarutan   rendah   dapat   ditingkatkan   dengan   masuknya   zatterlarut yang berkelarutan lebih tinggi. Jadi pelarut organik atau polietilen glikol bersama-samadengan penyesuaian pH dapat menghasilkan endapan yang diinginkan. Salah satu contoh darimetode   dalam   pemurnian   ragi   fosfofruktokinase.Peningkatan kelarutan (pada pH tertentu dan suhu tertentu) dengan peningkatan konsentrasigaram dikenal sebagai "salting in". Kebalikan dari proses ini, dengan pengenceran atau dialisis,adalah lebih mungkin berguna dalam pemurnian enzim. Sebuah penggaraman khas dalam kurvauntuk  protein  murni, sedangkan stepness  dari  respon  terhadap  garam  mungkin  cukup  untukmendorong   pengendapan   dengan   pengenceran.Point   Catatan   PraktekPresipitat isoelektrik kebanyakan agregat protein yang berbeda dan mungkin termasuk partikulatfragmen   dan   kompleks   protein   asam   nukleat.   Jika   komposisi   awal   larutan   berubah,   sebuahenzim yang diinginkan mungkin tidak memperlihatkan perilaku kelarutan yang sama. Endapanisoelektrik biasanya terjadi dengan menurunkan pH di bawah pH fisiologis, pastikan enzim stabilpada pH yang dibutuhkan. Menjaga suhu rendah akan meningkatkan kemungkinan stabilitas danpenurunan kelarutan. Namun, jika menyesuaikan pH di 0 ^oC, jangan lupa untuk standarisasi pHmeter   pada   suhu   ini,   dengan   menggunakan   buffer   standar   es   dingin.Singkatnya, penggaraman dalam rentang dapat dimanfaatkan dalam pemurnian dalam dua carayang berbeda. Pertama, agregasi dapat terjadi dengan pengenceran atau dialisis, dan jika enzimyang   diperlukan   hadir   dalam   pemurnian   agregat   berguna   akan   telah   dicapai.   Kedua,   curahisoelektrik   dapat   digunakan,   mengeksploitasi   variasi   kelarutan   dengan   pH,   tanpa   mengubahkekuatan ion. Dalam situasi baik, adalah enzim yang diperlukan tetap dalam larutan, dengantingkat pemurnian dicapai biasanya minimal sejak proporsi yang relatif kecil dari total proteinyang mungkin dalam endapan. Dalam hal ini, apa yang terjadi hanya membersihkan ekstrakProsedur selanjutnya yang ketiga yaitu proses elektroforesis kertas. Kertas saringyaitu selulosa asetat diberi garis dan ditotolkan 3 totolan (A=albumin; G=globulin; S=serumdarah) menggunakan pensil ditengahnya secara melebar. Sampel ditotolkan pada masing-masing   jenis   totolan.   Kertas   yang   sudah   mengandung   noda   ini   ditempatkan   kealatelektroforesis yang didalamnya mengandung buffer. Kemudian alat elektroforesis diatur dandinyalakan. Didiamkan selama 22 jam. Selanjutnya kertas diangkat dan diwarnai denganbromfenol   biru,   dikeringkan   dan   noda   dicuci   dengan   asam   asetat.   Pergerakan   nodadiidentifikasi.Elektroforesis merupakan metode pemisahan komponen protein didalam medan listrikyang elektroda dari protein bergerak ke muatan yang berlawanan. Pada dasarnya proses elektroforesis menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap pergerakan partikel-partikel ataumolekul-molekul yang bermuatan, dalam hal ini termasuk protein. Molekul atau partikeltersebut akan bergerak (terjadi pemisahan) berdasarkan ukuran berat atau muatan listrik yangdikandung pada protein. Proses elektroforesis pada praktikum ini pemberian garis pada kertassaring menggunakan pensil. Pensil ini bersifat inert atau tidak mudah bereaksi, sehingga nodapensil   yang   terbentuk   tidaka   akan   bergerak   atau   tidak   akan   mempengaruhi   proseselektroforesis. Menggunakan  kertas selulosa  asetat  sebagai  media   tempat bermigrasinyapartikel. Kertas selulosa asetat harus dijaga agar tetap bersih, misalnya terbebas dari sentuhantangan karena dapat meninggalkan lemak dan mengganggu aliran listriknya. Selain kertasselulosa   asetat,   media   lain   yang   digunakan   adalah   larutan   bufer.   Larutan   bufer  yang berfungsi   sebagai   jembatan   konduksi   antara   dua   elektroda   sehingga   memungkinkanterjadinya aliran listrik. Selain itu bufer dapat berperan sebagai penstabil medium pendukungdan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yangbermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliranlistrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ionrendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal danmigrasi molekul protein sangat lambat.Analisis elektroforesis kertas menggunakan indicator brom fenol biru, agar pemisahanzat warna dapat diamati dengan jelas.

Molekul-molekul yang akan di pisahkan (running) tersebut diteteskan pada masing-masingkertas selulosa asetat dengan jarak tertentu, kemudian ditempatkan pada alat elektroforesisdan ditambahkan larutan bufer selanjutnya di running. Sebelum di running beberapa molekulsudah terpisah terlebih dahulu, hal ini mungkin disebabkan tetesan molekul tersebut terlalubesar atau pekat atau penambahan larutan bufer terlalu banyak, sehingga larutan tersebutberdifusi dengan cepat  ke  kertas  selulosa asetat  dan menyebabkan pigmennya  pun ikutberdifusi. Proses running harus dilakukan searah dengan serat kertas agar proses migrasinyaberjalan dengan sempurna menuju ke suatu elektroda.Berdasarkan hasil pengamatan, semua molekul yang dianalisis pada praktikum inimemiliki muatan negatif yang ditandai oleh pergerakan ion menuju kutub positif.

Perbedaan   molekul   yang   di   running   tersebut   terletak   dari   pemisahan   warna   dan   jarakpergerakannya dari titik  awal. Indikator bromfenol biru, diteteskan pada masing-masingnoda. Brom phenol blue menunjukkan pemisahan warna menjadi biru tua. Terdapat beberapakesalahan yang terjadi pada metode elektroforesis kertas ini.Hal-hal   yang   dapat   mempengaruhi   dalam   proses   elektroforesis   kertas   yaitupergerakan noda dengan pembuatan spot sangat mempengaruhi hasil elektoforesis karenaakan mengganggu pemisahan zona-zona. Spot yang terlalu besar akan menyebabkan hasilrunning menjadi tidak beraturan. Ukuran spot terlalu kecil makan hasil  running akan sulitdiamati. Proses  running  elektroforesis memerlukan medium untuk menghantarkan listrik.Medium yang digunakan adalah buffer bromfenol biru. Bufer ini akan membasahi kertas danmenyebabkan kertas   dapat  menghantarkan  listrik  selama proses  running.   Spot  bergerakdengan arah menuju kutub positif atau negatif. Selain itu, pada saat proses pencelupan kertaske bufer elektroforesis harus dilakukan secara bersamaan, jika kedua ujung tidak bersamaan tercelup   ke   bufer   maka   hasil  running  akan   cenderung   bergerak   menjauhi   kertas   yangterbasahi oleh bufer lebih banyak. Proses pemberian arus listrik yang tidak konstan juga akanmembuat hasil kurang valid. Selain itu, kecepatan gerakan molekul juga berbanding lurusdengan besarnya voltase yang digunakan.

DAFTAR PUSTAKA

Rahmawaty,S. 2001. Petunjuk Praktikum Biokimia Gizi. Surakarta:Jurusan Gizi FIK UMS.